GRAIL发布海量临床研究数据，定义利用各种cfDNA测序在肿瘤早筛中的临床检测最低限度

**肿瘤早诊早治，一直是临床医生和患者梦想中的目标。** 近日，美国GRAIL公司在《Cancer Cell》杂志上发表了以“Evaluation of cell-free DNA approaches for multi-cancer early detection ”为题的文章，对比了10种针对cfDNA的测序分析技术在肿瘤早筛中的临床研究结果，定义了利用cfDNA测序进行多种肿瘤早筛的临床检测最低限度（LOD）。 ### 一、临床实验设计 美国GRAIL公司是cfDNA肿瘤早筛的龙头企业，有目前全球最大的测序公司Illumina为强大后盾，投入了庞大的资金与人力，进行肿瘤早筛的临床研究。该项研究在美国142个临床研究机构收集样本，共纳入健康人1172名，各类肿瘤患者1628名。为了完成10种不同的检测实验，每个参与研究的人都捐献了80mL外周血。  *图1. CCGA子研究1受试者分配* ### 二、10种不同的分类器 GRAIL同时利用10种不同的检测方法（分类器）进行结果分析，这10种基本囊括了目前cfDNA技术的常见方法，包括WG methylation（全基因组甲基化）、SNV（小的体细胞变异）、SNV-WBC（小的体细胞突变去掉噪音）、SCNA（体细胞拷贝数变化）、fragment endpoints（片段末端）、fragment lengths（片段长度）、allelic imbalance（等位基因不平衡）、SCNA-WBC（体细胞拷贝数目变化去噪音）、variant calling for allele fraction estimation（不同命名的等位基因碎片预测）、clinical datac[年龄、吸烟、家族史(乳腺、卵巢癌)]。 每种方法都是基于cfDNA的不同信息为判断依据，并联合使用其他循环分析物。在这篇文章之前，多癌症早期检测（MCED）报道中，还没有一个基于cfDNA各种基因组特征的严格的、系统的比较报告。GRAIL这篇文章将10种癌症分类器进行了系统的比较，验证了在各期肿瘤中的灵敏度。  *图2. 利用cfDNA测序的10种不同的分类器* ### 三、分类器特异性为 98% 的灵敏度 GRAIL认为在人群筛查试验中，一个重要的问题是不能加重假阳性人群的负担，因此选择相对较高的特异性（98%），但后果是牺牲了灵敏度。 在特异性为98%条件下， 最好的分类器的灵敏度分别是：全基因组（WG）甲基化（训练， 39%；验证，34%）， 单核苷酸变异（SNV）与配对的白血 细胞（WBC） 背景去除（SNV-WBC；训练，36%；验证，33%），以及泛特征分类器（训练，40%；验证，36%）。所有癌症分类器的敏感性随着临床癌症分期的增加而增加。  *图3. 原型癌症信号检测分类器特异性为 98% 的性能指标（灵敏度）* ### 四、不同分类器在癌症信号检测的ROC曲线 ROC曲线证明了每个经过训练的分类器的假阳性率和真阳性率之间的关系。曲线下面积(AUC)越大表示性能越好，0.5以上才具有判断意义，1是百分之百准确。  *图4. 不同分类器在癌症信号检测的ROC曲线* 本文中，在特异性为98%时，这几种分类器中，SNV-WBC（AUC：0.64），SCNA-WBC（AUC：0.64），全基因组（WG）甲基化（AUC：0.63），SNV（AUC：0.56），AUC的值较低，疾病的判断力较差。  *图5. 不同分类器在癌症信号检测的AUC值* ### 五、每个癌症信号检测分类器的临床LOD cfDNA测序技术是通过检测外周血中肿瘤细胞脱落的基因组的变化来检测肿瘤。但是，早期肿瘤（Ⅰ、Ⅱ期）较小，释放到外周血的游离DNA很少，并且cfDNA极易降解，所以癌症信号的检测限（LOD）对于cfDNA技术来说至关重要。 同时为了研究基于循环肿瘤等位基因分数（cTAF;参与者cfDNA中肿瘤特异性突变的相对数量的估计）的方法的分类器性能，GRAIL利用了检测限（LOD）的概念并创建了一个临床LOD测量。  *图6. 每个癌症信号检测分类器的临床LOD* *注：对于该分析，单个MCED测试的临床LOD定义为cTAF，其中检测到癌症信号的概率至少为50%，同时保持98%的特异性。* 这个结果与癌症信号检测分类器的灵敏度结果类似，WG甲基化、SNV-WBC和泛特征分类器的临床LOD最低，在千分之一左右的位置（0.001），彼此之间没有显著差异。本研究中所有cfDNA测序技术的检测灵敏度的范围在0.001-0.04。蓝色数据点表示使用的改进的靶向甲基化测定的估计临床LOD特异性为98%，MCED测试的临床LOD为3.1×10−4。 ### 六、不同分期的肿瘤的循环肿瘤等位基因占比 从结果可以看出，具有足够样本来分析相关趋势的癌症类型中（乳腺癌、结肠/直肠癌和肺癌），cTAF随临床癌症分期而增加。结合上一个图的结论，目前cfDNA测序技术的检测灵敏度的范围在1e-03~4e-02，而大多数Ⅰ期肿瘤处于1e-04及以下可以看出，对于Ⅰ期肿瘤的判断，cfDNA测序技术无法判断，但Ⅲ、Ⅳ期肿瘤的判准准确性较高。  *图7.cTAF按癌症分期分布* ### 七、预测癌症信号起源 cfDNA测序技术不仅可以筛查各种肿瘤，也可以对癌症信号（CSO）的起源进行预测追踪。本文选取了十几种常见肿瘤疾病进行交叉验证，从三种检测（WG甲基化，SCNA和SNV-WBC）中，每种检测中选择一种最佳的癌症信号检测特征来创建三种癌症信号起源（CSO）分类器。下图中x轴为真实值，y轴为预测值，WGBS准确预测了75%（95/127）的CSO，而SCNA和SNV-WBC分别准确预测了41%（52/127）和35%（44/127）癌症样本的CSO。    *图8. 使用联合检测的癌症样本验证集通过原型测定预测癌症信号起源的准确* ### 八、按癌症分期划分的癌症信号检测分类器的敏感性 在保证每种癌症信号检测分类器的特异性灵敏度为98%时，检测灵敏度随着临床癌症分期的增加而增加。Ⅰ期灵敏度为0-10%，Ⅱ期灵敏度为5-25%，Ⅲ期灵敏度为25-75%，Ⅳ期灵敏度为25-85%。橙色表示全基因组（WG）甲基化的性能分类器，为目前灵敏度最高的分类器。该结果表明，所有基于cfDNA测序的技术，很难检测到I，II期肿瘤。  *图9. 按癌症分期划分癌症信号检测分类器的敏感性* 在本篇文章中，**GRAIL公司的科学家们总结了基于cfDNA的多癌早筛的研发过程，将10种利用cfDNA测序技术进行肿瘤早期筛查的结果进行了系统性的对比分析。他们从庞大的临床研究数据中总结出cfDNA测序技术在早期肿瘤筛查中遇到的困难是因为目前所有的基于cfDNA测序的技术，都达不到早期肿瘤患者外周血中的循环肿瘤等位基因分数（cTAF）临床检测的最低极限（LOD）。**GRAIL的科学家们重新提出了新的研发方向，他们将利用靶向定点cfDNA甲基化测序技术，继续研究肿瘤早期筛查。 *原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ccell.2022.10.022* 撰文 | 羊薪衡 编辑 | 羊薪衡、张春曦 审稿 | 张志新